文/ 圖 美國(guó)路易斯安那州州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心水產(chǎn)研究站 胡軛

　　

　　精子凍存技術(shù)是一項(xiàng)在二十世紀(jì)中興起的冷凍保存技術(shù)。此技術(shù)首先在畜牧牛的育種中產(chǎn)生了革命性的影響，使歐洲和北美絕大多數(shù)養(yǎng)牛場(chǎng)得以依賴凍存精子進(jìn)行配種。收集、保存和交易有價(jià)值的種牛的精子已經(jīng)具有每年數(shù)億美元的全球化市場(chǎng)（圖1）。與此同時(shí)，其它畜牧業(yè)動(dòng)物豬、馬、羊等，也在迅速發(fā)展和趕超這一技術(shù)。美國(guó)農(nóng)業(yè)局下屬的國(guó)家農(nóng)業(yè)種質(zhì)項(xiàng)目不僅保存著近50萬(wàn)凍存管的奶牛和肉牛精子，還有20萬(wàn)份凍存的豬精子和6萬(wàn)份山羊和綿羊的精子作為美國(guó)畜牧的基因資源備份。此外，關(guān)于馬和雞的精子凍存技術(shù)的研究和應(yīng)用也是如火如荼。

　　

　　精子凍存技術(shù)給畜牧業(yè)尤其是優(yōu)良品系的擁有者提供了一退一進(jìn)兩手策略：退，能備份已有的遺傳性狀；進(jìn)，能交易和運(yùn)輸己有的遺傳物質(zhì)而獲得其它感興趣的遺傳性狀。正是這一退一進(jìn)的靈活性，促成了覆蓋全球的標(biāo)準(zhǔn)化凍存精子貿(mào)易網(wǎng)絡(luò)以及每年2300萬(wàn)凍存管的巨大交易量。

　　

　　精子冷凍技術(shù)首次在魚(yú)類上的實(shí)踐是在二十世紀(jì)五十年代，和家畜的研究基本同時(shí)起步，但魚(yú)類和貝類精子的凍存始終沒(méi)有成為生產(chǎn)應(yīng)用的主要技術(shù)之一。其主要原因在于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)去一直應(yīng)用自然交配的育種方式。然而，出于對(duì)遺傳性狀的重視，科學(xué)家們想方設(shè)法去提高其保存效率。

　　

　　在過(guò)去的六十年內(nèi)，對(duì)水產(chǎn)類生物精子的凍存研究以幾何倍數(shù)增長(zhǎng)，各國(guó)也在凍存技術(shù)的支持下陸續(xù)開(kāi)始建設(shè)種質(zhì)庫(kù)保存和備份水生生物多樣性。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織水產(chǎn)漁業(yè)部提出了重視水產(chǎn)遺傳物質(zhì)的綱要，法國(guó)國(guó)家水生動(dòng)物冷凍庫(kù)、墨西哥遺傳資源中心、以及中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院國(guó)家漁業(yè)種質(zhì)平臺(tái)都是國(guó)家級(jí)資源庫(kù)的成功范例。另一方面，醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的發(fā)展帶動(dòng)下的模式生物魚(yú)的擴(kuò)大養(yǎng)殖和原有的實(shí)驗(yàn)室空間產(chǎn)生了沖突，歐洲和美國(guó)的很多模式魚(yú)類中心已經(jīng)采用精子凍存技術(shù)來(lái)節(jié)省空間并通過(guò)郵寄凍存樣品來(lái)相互交流有研究?jī)r(jià)值的突變性狀。

　　

　　然而，針對(duì)多樣性保護(hù)的小規(guī)模凍存一方面不能實(shí)現(xiàn)規(guī)模化市場(chǎng)和生產(chǎn)的需求，一方面容易陷入對(duì)凍存步驟細(xì)節(jié)的過(guò)度考究而脫離了實(shí)際應(yīng)用。而且，因?yàn)樾∫?guī)模的凍存成本高產(chǎn)量小，不能在實(shí)際生產(chǎn)中接受長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)，更無(wú)法在實(shí)踐中尋找自身的不足而進(jìn)行進(jìn)化升級(jí)。

　　

　　高效魚(yú)類及貝類精子凍存項(xiàng)目在過(guò)去的十年里曾數(shù)次列為美國(guó)農(nóng)業(yè)局科研基金項(xiàng)目，其中路易斯安那州州立大學(xué)農(nóng)業(yè)中心水產(chǎn)研究院水產(chǎn)種質(zhì)實(shí)驗(yàn)室是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)魚(yú)類及貝類高效凍存的研究機(jī)構(gòu)。該項(xiàng)目主體由我在2012年完成，將自動(dòng)化設(shè)備和工業(yè)化設(shè)備與冷凍實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)量穩(wěn)定的大規(guī)模凍存，并在美國(guó)官方和私人養(yǎng)魚(yú)場(chǎng)進(jìn)行了多次實(shí)踐，獲得了穩(wěn)定的收益。這一高效凍存體系之所以能提高到工業(yè)化層面而不是機(jī)械地將數(shù)個(gè)小規(guī)模凍存進(jìn)行疊加，歸功于三個(gè)特征：車間化和自動(dòng)化、規(guī)范化質(zhì)量控制、以及過(guò)程模擬分析。

　　

　　車間化和自動(dòng)化是提高效率的第一步。這其中包括工作環(huán)境的選擇、設(shè)備和工具選擇、流水線設(shè)計(jì)。車間化保證了精子樣品在加工處理過(guò)程中移動(dòng)的順暢，自動(dòng)化降低了操作誤差。目前被采用的自動(dòng)化分裝系統(tǒng)只有法國(guó)和德國(guó)有，但都使用0.5ml凍存管為基本容器。我們?cè)O(shè)計(jì)的高效凍存體系兼容了兩套系統(tǒng)（圖2），并采用美國(guó)需求量大的魚(yú)種——藍(lán)鯰魚(yú)作為示范魚(yú)種。整個(gè)系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了只用3個(gè)人工日產(chǎn)1000管的產(chǎn)量。這一產(chǎn)量已經(jīng)和美國(guó)大規(guī)模雜交鮰魚(yú)（斑點(diǎn)叉尾鮰母魚(yú)和藍(lán)鯰魚(yú)公魚(yú)雜交）育苗場(chǎng)的精子日使用量相一致。為了進(jìn)一步證明凍存精子在實(shí)際生產(chǎn)中的功效，我們連續(xù)3年和大規(guī)模育苗場(chǎng)合作，使用凍存精子替代育苗場(chǎng)所需新鮮采集的精子的一半，其它育苗程序都保持不變。最終，同樣體積的凍存精子和新鮮精子孵化出同等數(shù)目的苗。

　　

　　達(dá)到這個(gè)級(jí)別的孵化率也要?dú)w功于高效凍存的規(guī)范化質(zhì)量控制。整個(gè)凍存過(guò)程是精密的細(xì)胞生化反應(yīng)，因此各個(gè)細(xì)節(jié)都可能帶入一定的影響因素，而因?yàn)榧?xì)胞自我調(diào)節(jié)能力，累積的影響往往只在最后的產(chǎn)品中體現(xiàn)出來(lái)（較低的復(fù)蘇率）。因此每一個(gè)步驟都需要把帶入的影響減到最低。我們采用了工業(yè)工程的方法詳細(xì)地制定了每一個(gè)步驟的規(guī)程，同時(shí)也設(shè)定了數(shù)量化的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，這套凍存體系采用了數(shù)量化質(zhì)量控制方法（三倍標(biāo)準(zhǔn)差原理），時(shí)時(shí)監(jiān)控重要生產(chǎn)環(huán)節(jié)，最大程度的保證質(zhì)量，在同行中處于領(lǐng)先地位。

　　

　　介于高效凍存系統(tǒng)的設(shè)置需要因地制宜、因物種而變化，已建立的高效凍存系統(tǒng)由于人員經(jīng)費(fèi)的關(guān)系只能在較小的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。因此需要一種補(bǔ)充的分析手段來(lái)進(jìn)行系統(tǒng)運(yùn)行預(yù)測(cè)。我們借助ARENA（Rockwell Automation） 的可視化效果進(jìn)行過(guò)程模擬（圖3），把整個(gè)高效凍存搬上電腦屏幕。這套虛擬化的高效凍存系統(tǒng)可以檢測(cè)人員增減、工時(shí)工量變化、生產(chǎn)線改良等各種假定，并給出時(shí)間、成本、產(chǎn)出等重要指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析。這些為進(jìn)一步推廣和建設(shè)新的高效凍存提供了強(qiáng)大的信息資源以供參考。

　　

　　魚(yú)類的精子凍存已經(jīng)在三文魚(yú)養(yǎng)殖中起到舉足輕重的作用。北歐的三文魚(yú)養(yǎng)殖已經(jīng)完全采用了精子凍存進(jìn)行魚(yú)卵孵化。優(yōu)良的種魚(yú)的精子采集之后被凍存起來(lái)，并運(yùn)送到需要的種苗場(chǎng)孵化魚(yú)卵。更進(jìn)一步的是，由于三文魚(yú)的魚(yú)卵已經(jīng)有了可靠的保存方法，三文魚(yú)跨國(guó)公司可以將魚(yú)卵和精子分別運(yùn)送到加拿大和智利，并在當(dāng)?shù)剡M(jìn)行孵化繁殖，減低了運(yùn)輸成本，使場(chǎng)地更靠近消費(fèi)群體。

　　

　　以三文魚(yú)為典范，目前，我們正在進(jìn)一步推廣高效魚(yú)類及貝類精子凍存項(xiàng)目在水產(chǎn)尤其是育苗領(lǐng)域的應(yīng)用（圖4）。精子冷凍項(xiàng)目所需的關(guān)鍵技術(shù)支持是人工授精。目前幾乎所有魚(yú)類和貝類都能進(jìn)行人工授精。在人工授精的前提下，使用高效魚(yú)類及貝類精子凍存項(xiàng)目可以提供三個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：保種苗、促育苗和強(qiáng)化特種品系控制。

　　

　　保種苗：優(yōu)良的品種是水產(chǎn)的關(guān)鍵。一旦有了好的養(yǎng)殖品種，育種站將投入巨大的精力和資源保護(hù)和維護(hù)種魚(yú)。然而，維護(hù)活體的成本和風(fēng)險(xiǎn)都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)維護(hù)凍存精子。有了凍存技術(shù)，帶有優(yōu)良品質(zhì)的精子將從種魚(yú)中收集并保存在液氮中。一旦出現(xiàn)極端情況種魚(yú)死亡，凍存的精子可以通過(guò)簡(jiǎn)單直觀的三代回交，產(chǎn)生擁有被保存品種93%遺傳性狀的新魚(yú)（回交次數(shù)越多，新魚(yú)和被保存品種越接近）。而高效凍存的自動(dòng)化系統(tǒng)精確標(biāo)記了每一個(gè)凍存管，方便精確查找和定位已保存的樣品。

　　

　　促育苗：育種過(guò)程中因?yàn)檫x擇方向的多樣，往往會(huì)形成龐大的選擇矩陣。由于資源和時(shí)間的局限，在選育工程中的有價(jià)值的個(gè)體可能會(huì)因?yàn)楹椭饕�選擇方向不一致而被舍棄。同樣的情況也可能出現(xiàn)在已有品種不盡如人意，鑒于場(chǎng)地限制而被舍棄。一旦個(gè)體被銷毀，便沒(méi)有辦法再追溯和利用該品系的優(yōu)良性狀。

　　

　　而采用凍存技術(shù)輔助育種可以實(shí)時(shí)“備份”各個(gè)中間品系，一旦需要調(diào)整選擇方向，可以方便地使用相應(yīng)的凍存精子而不用從頭開(kāi)始。并且，在育苗過(guò)程中使用盛有同一親本來(lái)源精子的凍存管可以方便地同時(shí)孵化數(shù)條母魚(yú)的魚(yú)卵，從而解決因選定的母魚(yú)不能同時(shí)產(chǎn)卵或不在同一個(gè)地域而無(wú)法活體育苗的問(wèn)題。

　　

　　強(qiáng)化特種品系控制：特種品系指的是用來(lái)雜交的高價(jià)值種魚(yú)或是基因工程產(chǎn)生的“超級(jí)雄魚(yú)”（YY雄魚(yú)）或是用來(lái)產(chǎn)生三倍體后代的四倍體親本（如牡蠣）。這些品系有著極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并常常牽涉到技術(shù)專利。因此，這些品系的活體都受到嚴(yán)格控制。使用凍存技術(shù)可以采集和保存精子，并將精子輸送到其他的育苗站進(jìn)行育苗。這樣就避免活魚(yú)的流失，同時(shí)精子接受方即使有了精子，在沒(méi)有相應(yīng)雌魚(yú)的基礎(chǔ)上，也不可能產(chǎn)生相應(yīng)的特種品系。值得注意的是，品系的控制和轉(zhuǎn)移也可以應(yīng)用到一般魚(yú)種上。尤其是當(dāng)一個(gè)魚(yú)種站需要關(guān)閉或轉(zhuǎn)移時(shí)，及時(shí)凍存已有的種質(zhì)資源可以方便轉(zhuǎn)移和其他魚(yú)種站的使用。

　　

　　高效魚(yú)類及貝類精子凍存項(xiàng)目將改變傳統(tǒng)觀念中只有活魚(yú)才能代表良種品系的思維，而建立品系和生殖細(xì)胞（精子）的直接聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)更為靈活有效的轉(zhuǎn)移和管理。在互通有無(wú)的交易和交流中，使種苗場(chǎng)和農(nóng)戶最大程度地受益于各種優(yōu)良的遺傳性狀，整體提高中國(guó)水產(chǎn)的生產(chǎn)力和競(jìng)爭(zhēng)力。

　　

　　圖1 1979至2012美國(guó)凍存牛精子出口貿(mào)易額度（數(shù)據(jù)來(lái)源www.NAAB-CSS.org）

　　

　　圖2 法國(guó)CryoBioSystem公司的凍存管自動(dòng)分裝系統(tǒng)MAPI（左）和德國(guó)Minitube公司的凍存管自動(dòng)分裝系統(tǒng)MPP Quattro（右）是目前最主要的自動(dòng)化系統(tǒng)

　　

　　圖3 虛擬藍(lán)鯰魚(yú)精子凍存過(guò)程在ARENA軟件上的可視化界面

　　

　　圖4 凍存精子輔助下的種魚(yú)種苗管理